高通量测序数据上传指南
引
很多老师在写文章的时候，精力通常会放在文章中的技术或者实验细节，而疏忽原始数据上传的工作。文章准备接收时，审稿人需要老师提供文章中使用数据的登录号，一般时间要求较紧，对于没接触过数据上传的老师来说，可能会成为文章接收最后的绊脚石，为此我们撰写了一份高通量测序数据上传指南，可以让老师快速掌握数据上传的技能，助力老师文章发表。
目前高通量测序原始数据通常上传到NCBI的SRA(The Sequence Read Archive)数据库，部分老师会纠结是否需要把测序数据上传至GEO数据库，这里无需多虑，因为测序数据上传到GEO之后，最终也是存放在SRA；而且SRA相对于GEO来说，上传过程更快速、便捷。
本指南以上传SRA数据库为例，整体篇幅以截图为主，并辅以文字描述，方便老师对照网页操作。
在数据上传过程中可能会要求填写实验细节，有些可能不明确或者不适用，如果没有特殊需要，部分细节可以不用过于纠结。数据成功上传后会生成一个Accession Number，最终加入文章中，审稿人或者其他人能够通过该Accession Number查询、下载到对应数据。
话不多说，直接上干货~
01
登录/注册
1.1 进入NCBI数据上传主页
主页链接
，如图：
Sequence Read Archive：填写样本信息、上传样本数据
BioProject：填写项目信息
BioSample ：填写样本属性
1.2 Login in/Register (有账号可以跳过1.2和1.3)
点击右上角Login，如果在NCBI注册过，可以输入账号密码登陆，如果未注册可以点击Register for NCBI account注册：
1.3 验证邮箱
注册完毕后会向所填写的邮箱中发送验证邮件，点击邮件中的链接即可激活账号。再次回到第二步之后的界面，此时会自动登录。
注：提交过程中如果出现以下的登陆方式选择，一律选择NCBI PDA登陆
02
创建研究项目-BioProject
回到上传主页
，点击BioProject：
页面跳转后点击New submission：
2.1 SUBMITTER
进入创建BioProject页面Submitter选项卡，填写必要个人信息：
2.2 PROJECT TYPE
在Project Type选项卡中依次选择相应的类别，此处以普通转录组测序为例，勾选原始测序数据：
2.3 TARGET
进入Target选项卡，填写物种名称 (此处填写的物种拉丁文名称需在NCBI中有收录，输入关键词后选择弹窗的物种信息，否则会提示找不到该物种名)，继续下一步：
2.4 GENERAL INFO
进入General Info选项卡；第一个选项是问此数据是否马上发布，还是指定特定日期发布(释放日期可以给NCBI写邮件更改)。其他填写带星号的必填内容，继续下一步：
2.5 BIOSAMPLE
进入BioSample选项卡，需要指定项目中包含的BioSample，可以先略过，也可以先去创建BioSample。此处先略过，点击继续：
2.6 PUBLICATIONS
进入Publications选项卡，如有已发表文章，可以指定PubMedID或DOI，没有请略过：
2.7 OVERVIEW
最后Overview中可以浏览概况，确认无误后点击Submit提交：
2.8 获得PRJ ID
提交后会回到BioProject界面，列表中会显示刚才的项目已经提交正在审核(Awaiting processing)。一般几分钟就能审核完毕，刷新就可以看到Processed，并可以看到BioProject编号 (PRJ开头)：
03
创建生物样品-BioSample
回到上传主页，点击BioSample ：
页面跳转后点击New submission：
3.1 SUBMITTER
进入创建BioSample页面Submitter选项卡，填写/完善必要的个人信息：
3.2 GENERAL INFO
在General info选项卡中，第一个是选择是否立即发布(和上面的Bioproject的类似)，第二个选择是问是否有多组样品，如果选多组样品的话，会要求上传表格文件，用于描述各样品的属性，比较繁琐；可选择单样品，不影响后续上传：
3.3 SAMPLE TYPE
在Sample Type选项卡中根据样本实际情况选择：
3.4 ATTRIBUTES
Attributes选项卡，按情况填写星号内容(此处Sample Name可以自行填写，物种信息参考上面Bioproject的操作，填写完整的拉丁文名称-需要下拉列表有显示对应的物种名)：
3.5 BIOPROJECT
BioProject选项卡，输入刚才创建的BioProject编号：
3.6 DESCRIPTION
Description选项卡，信息如果不需要更改按照默认的即可：
3.7 OVERVIEW
最后Overview中浏览概况，确认无误后点击Submit提交：
3.8 获得SAM ID
提交后会回到BioSample界面，列表中会显示刚才的项目已经提交正在审核(Awaiting processing)。一般几分钟就能审核完毕，刷新就可以看到Processed，并可以看到BioSample编号 (SAM开头)：
04
创建SRA
回到上传主页
，点击Sequence Read Archive：
页面跳转后点击New submission：
4.1 SUBMITTER
进入创建SRA页面Submitter选项卡，填写/完善必要个人信息：
4.2 GENERAL
在General选项卡里，选择前面创建的BioProject，是否已经创建好了BioSample选择Yes，发布日期根据实际情况选择：
4.3 METADATA
在Metadata选项卡，填写提交数据的相关实验信息，这一步可以直接在网页上填写，示例如下：
也可以下载模板表格填好之后再上传：
*Filetype如果只有fa文件也可以选择fastq格式(NCBI会默认上传的fa文件碱基质量值为30)
*Filename填写的文件名称必须和上传的序列文件名称一致(后台通过表格信息关联上传的数据，如果名称不一致会提示文件缺失)，如“Filename”、“Flename2”分别填写了Sample_A.R1.fastq.gz、Sample_A.R2.fastq.gz，那么该样本的R1、R2端数据的文件名也必须是Sample_A.R1.fastq.gz、Sample_A.R2.fastq.gz。
4.4 FILES
在Files选项卡里，对于上传数据的方式，我们通常选择FTP or Aspera Command Line file preload：即使用FTP工具(Filezilla)或命令行传输(ascp)：
4.4.1 FTP传输-Filezilla
下载Filezilla() 安装好之后并做如下设置：
根据网页提供的FTP地址、账号、密码用Filezilla连接上服务器。如果一直读取目录失败，可以直接将3. Navigate to your account folder下面的目录(如“uploads/upload@oebiotech.com_hzWLqygv”)复制进Filezilla的远程站点里(注意路径要以斜杠“/”开头)，然后回车键就能进入目录了，进入目录后再创建一个子目录并进入(如果上传的数据不在新创建的子目录中上传的文件不会被检测到！)：
将数据文件直接拖进右侧区域(新创建的子目录)等待上传完毕：
4.4.2 命令行传输-Aspera 上传/ascp
往SRA上传输数据的时候，有时会遇到Filezilla传输慢的情况，这时候就需要Aspera软件帮忙了。
软件官网下载链接：
网盘下载链接：
Windows：
提取码: yw24
Mac OS：
提取码: gy55
下载好解压缩即可，解压缩的路径一会要用到，例如D:Asperacliin
Aspera环境变量设置(以windows为例)：右键我的电脑-属性-高级设置-环境变量设置-PATH里添加软件的路径(D:Asperacliin)
windows 键+R 弹出运行框，输入cmd 回车进行进入cmd界面，输入ascp –h可正常显示 ：
在Aspera command line upload instructions ，可以查看到命令行：
注意命令行中提及的key_file(上图红圈部分)点击下载key文件aspera.openssh并存放在指定位置，如 "D:Aspera"；数据上传完整命令如下：
ascp -i D:Asperaspera.openssh -QT -l100m -k1 -d F:upload_OE-data subasp@upload.ncbi.nlm.nih.gov:uploads/upload@oebiotech.com_3pZCtpnp/upload_OE-data
-i 之后填写前面下载的aspera.openssh文件的绝对路径("D:Asperaspera.openssh")
-d 之后填写需要上传的数据文件的路径，这个路径下除了待上传的原始数据最好不要存放其他文件("F:upload_OE-data")
"空格"之后接NCBI的远程路径
("subasp@upload.ncbi.nlm.nih.gov:uploads/upload@oebiotech.com_3pZCtpnp/upload_OE-data")
远程路径后面需要添加一个子目录("upload_OE-data")，否则上传的数据检测不到！
命令输入后回车显示传输，等待提示传输完毕，传输中断可重复之前的命令。
数据上传成功之后(这一过程消耗的时间根据文件数量、大小及网速决定)做如下操作：
确认没问题，点击继续：
4.5 OVERVIEW
最后Overview中浏览概况，确认无误后点击Submit提交：
05
完成上传
可以在
查看审核状态：
目前测序数据上传完成。NCBI会在后台审核数据，最后给出Accession Number，一般一天左右。
审核完毕的数据可能不会马上被NCBI收录，一般需要2-4天才能被搜索到(如果设定了发布时间，则在发布时间之后才能搜到)。可以在SRA的Submission中()查询到目前的审核进度。
注意最终使用的Accession Number一般为Run的编号，SRR开头。可以点击Submission Id进入查看Accession Number：
Tips：上传过程中遇到任何问题(如下图的报错信息)可以直接邮件联系NCBI请求帮助(邮箱：sra@ncbi.nlm.nih.gov)
至此，整个数据上传就已经全部完成了；Accession Number放进文章，完成文章接收的最后一步。
SRA数据上传的界面会时有更新，我们也会定期跟踪，及时更新，确保本指南的实用性。
本文系欧易生物原创
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